Bakterielle c

Nature Microbiology (2023)Diesen Artikel zitieren

16 Altmetrisch

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Die meisten Mikroben entwickeln sich schneller als ihre Wirte und sollten daher die Entwicklung der Wirt-Mikroben-Interaktionen vorantreiben. Über die Merkmale, die den adaptiven Weg von Mikroben zur Wirtsassoziation definieren, ist jedoch relativ wenig bekannt. Hier haben wir mikrobielle Merkmale identifiziert, die die Anpassung an Wirte vermitteln, indem wir das frei lebende Bakterium Pseudomonas lurida mit dem Nematoden Caenorhabditis elegans als Wirt experimentell weiterentwickelten. Nach zehn Passagen beobachteten wir wiederholt die Entwicklung nützlicher wirtsspezialisierter Bakterien, wobei eine verbesserte Persistenz im Nematoden mit einer erhöhten Biofilmbildung einherging. Die Sequenzierung des gesamten Genoms ergab Mutationen, die den bakteriellen sekundären Botenstoff, zyklisches Diguanylat (c-di-GMP), gleichmäßig hochregulieren. Anschließend erzeugten wir Mutanten mit hochreguliertem c-di-GMP in verschiedenen Pseudomonas-Stämmen und -Arten, was die Wirtsassoziation kontinuierlich erhöhte. Der Vergleich von Pseudomonadengenomen aus verschiedenen Umgebungen ergab, dass c-di-GMP der Anpassung an eine Vielzahl von Wirten zugrunde liegt, von Pflanzen bis hin zu Menschen. Diese Studie zeigt, dass c-di-GMP für den Aufbau einer Wirtsassoziation von grundlegender Bedeutung ist.

Wirtsassoziierte Mikroorganismen haben wichtige Auswirkungen auf die physiologische Funktion und Fitness ihrer pflanzlichen und tierischen Wirte1,2,3. Diese Wirt-Mikrobiota-Wechselwirkungen werden häufig aus einer wirtszentrierten Sichtweise untersucht, wobei der Schwerpunkt auf Mikrobiota-vermittelten Wirtsfunktionen liegt. Diese Ansicht vernachlässigt die wichtige Tatsache, dass sich die meisten Mikroben aufgrund ihrer kürzeren Generationszeiten und höheren Mutationsraten schneller entwickeln als ihre Wirte und dass daher Fitnessverbesserungen der Mikroben die Assoziationen überproportional vorantreiben können4. Ein wichtiger Schritt in der Entwicklung einer Wirt-Mikroben-Assoziation ist die Entstehung einer spezialisierteren Interaktion, die es freilebenden Bakterien ermöglicht, zuverlässig in den Wirt einzudringen, zu überleben und schließlich in die Umwelt freigesetzt zu werden, um neue Wirte zu besiedeln (Abb. 1a)4 . Bisher ist wenig über die Merkmale und molekularen Prozesse bekannt, die bestimmen, wie sich Bakterien an eine solche Assoziation mit dem Wirt anpassen.

a) Wirtsassoziierte Mikroben gehen von einer frei lebenden Phase in eine Wirtsassoziation über, wobei letztere den Wirtseintritt, die Persistenz und die Freisetzung umfasst. Sechs P. lurida-Populationen wurden zehnmal über diese Stadien mit dem Wirt C. elegans (EVOhost) oder ohne den Wirt als Kontrolle (EVOctrl) passagiert. b: An den Wirt angepasste Bakterienpopulationen steigerten die Fitness (angegeben als cfus pro Wurm) im Vergleich zum Vorfahren signifikant (zweiseitige t-Tests und FDR-korrigierte Tukey-Post-hoc-Vergleiche, 6 Wiederholungen pro Behandlung). c, Entwickelte Bakterien bleiben für den Wirt von Vorteil, bestimmt durch das Wachstum der Nematodenpopulation (zweiseitiger t-Test, 6 Wiederholungen pro Behandlung). d, Ein faltiger Koloniemorphotyp entstand nur während der Wirtsanpassung und dominiert bei Würmern (Vergleich der Morphotyphäufigkeit innerhalb der Behandlungen: verallgemeinerte lineare Modelle und FDR-korrigierter Tukey-Post-hoc-Test, 6 Wiederholungen pro Behandlung). e: Entwickelte wirtsspezialisierte Bakterien (gekennzeichnet mit rot fluoreszierendem dTomato) besiedeln den Wurmdarm (autofluoreszierende Vesikel in Nematoden-Darmzellen in Cyan). Maßstabsbalken, 10 µm. f, PCA der Schlüsselmerkmale des wirtsassoziierten Lebenszyklus (in a) zeigt ein deutliches Profil für weiterentwickelte Faltenwirtsspezialisten im Vergleich zu Vorfahrenbakterien (siehe Ergänzungstabelle 5 für Messungen einzelner Merkmale). b–d, Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), obere und untere Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker).

Wir untersuchten den evolutionären Übergang vom Freileben zur Wirtsassoziation durch kontrollierte experimentelle Evolution, wobei wir das Bakterium Pseudomonas lurida und den Nematodenwirt Caenorhabditis elegans als Modell verwendeten. Dieses Bakterium kommt gelegentlich in der natürlichen Mikrobiota von C. elegans5,6 vor. Unter Laborbedingungen ist das Vorhandensein von P. lurida mit einer erhöhten Wachstumsrate der Population von C. elegans verbunden und kann Schutz vor Krankheitserregern bieten. Dennoch können sich Wirt und Bakterium unabhängig voneinander vermehren und sind daher nicht voneinander abhängig5,7,8 . Um wirtsadaptierte Bakterien auszuwählen, haben wir 6 P. lurida-Populationen seriell passagiert, entweder mit oder ohne wirtsassoziierte Phase (Abb. 1a; EVOhost bzw. EVOctrl). Alle Populationen wurden mit demselben klonalen Vorfahren geimpft. Nach 10 Passagen durch Wirte erreichten die Bakterien im Wirt eine durchschnittlich 5–10-mal höhere Bakterienlast als ihr Vorfahre, eine signifikante Veränderung, die bei der Kontrolle nicht beobachtet wurde, die sich ohne Kontakt mit Wirten entwickelte, ansonsten aber identische Bedingungen aufwies (Abb. 1b und erweitert). Daten Abb. 1). Die erhöhte bakterielle Fitness ging nicht zu Lasten des Wirts, da sich das Wachstum der Nematodenpopulation (das als Indikator für die Fitness der Nematoden verwendet wird5) nicht wesentlich veränderte, sondern in Gegenwart der angepassten Bakterien eher zunahm (Abb. 1c).

Durch die Passage diversifizierten sich die Koloniemorphologien der Bakterienpopulationen. Am Ende unseres Experiments dominierte ein „faltiger“ Morphotyp in allen wirtsassoziierten experimentellen Replikatpopulationen und fehlte in den Kontrollen, wohingegen „unscharfe“ und „glatte“ (Vorfahren-) Morphotypen bei allen Behandlungen vorhanden waren (Abb. 1d und Ergänzungstabelle). 1). Trotz ihres erheblichen Vorteils bei den Wirten nahmen die faltigen Morphotypen während des Wachstums auf Agar ab, während die Häufigkeit glatter und flockiger Typen zunahm (Erweiterte Daten, Abb. 1 und Ergänzungstabelle 2). Da es sich bei den faltigen Arten nur um wurmadaptierte Bakterien handelte und diese eine sehr hohe Häufigkeit aufwiesen, betrachteten wir sie als Wirtsspezialisten. Diese Spezialisten können in Clustern im Darmtrakt des Fadenwurms gefunden werden, insbesondere im vorderen und hinteren Teil (Abb. 1e und erweiterte Daten Abb. 2). Bemerkenswerterweise ähnelt der entwickelte faltige Morphotyp dem faltigen P. fluorescens, der an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche in statischen Mikrokosmen entsteht9, und den rauen Varianten verschiedener pathogener Bakterien10,11,12. Unsere Experimente legen nahe, dass diese morphologische Veränderung auch bei nützlichen Bakterien auftritt, die sich an die Wirtsassoziation anpassen. Zur weiteren Charakterisierung dieser Anpassungen konzentrierten wir uns auf 47 Klone der unterschiedlichen und genetisch stabilen Morphotypen (Ergänzungstabelle 3), die aus den Endpopulationen unseres Evolutionsexperiments isoliert wurden.

Eine Analyse der Merkmalsveränderungen in den einzelnen Stadien der Wirtsassoziation ergab spezifische Anpassungen runzliger Morphotypen an die Interaktion mit C. elegans. Im Detail haben wir zwei Merkmale charakterisiert, die für das Freilebensstadium wichtig sind, und vier Merkmale für die Wirtsassoziation (wie in Abb. 1a aufgeführt). Wir fanden heraus, dass sich die faltigen Isolatprofile deutlich vom Profil der Vorfahrenmerkmale unterschieden (Abb. 1f und Ergänzungstabelle 4). Dies war hauptsächlich auf einen signifikanten Anstieg der kurzfristigen Persistenz, der Freisetzung aus dem Wirt und der In-vitro-Biofilmbildung zurückzuführen (Abb. 1f, erweiterte Daten Abb. 3 und Ergänzungstabellen 4–6) – alles Merkmale, die Spätphaseninteraktionen mit dem Wirt definieren Gastgeber. Das Gesamtmuster einer verbesserten Wirtsassoziation wurde auch durch die Analyse der genetisch vielfältigen Populationen vom Ende des Evolutionsexperiments wiederhergestellt, wobei die Persistenz und Freisetzung der wirtsassoziierten Populationen in ähnlicher Weise zunahm (Erweiterte Daten, Abb. 4 und Ergänzungstabellen 7 und 8). Im Detail kann die Biofilmbildung einen dauerhaften Kontakt mit dem Wirt ermöglichen und die Stresstoleranz13,14 erhöhen, wie es bei vielen Krankheitserregern der Fall ist15, wodurch das Überleben im Verdauungstrakt des Nematoden verbessert wird. Als Folge der erhöhten Biofilmbildung können aggregierte Zellen leichter ausgestoßen werden16, was den beobachteten Anstieg der Freisetzung erklärt. Ein solcher Verlust erhöht auch die Wahrscheinlichkeit einer Übertragung auf andere Wirte4, wodurch der Zyklus der Wirtsassoziation neu gestartet wird. Bemerkenswerterweise unterschieden sich faltige Isolate in der frühen Besiedlung nicht von ihren Vorfahren, zeigten jedoch eine signifikante Abnahme der Kolonieausdehnung und des Schwärmens auf Platten (Abb. 1f, erweiterte Daten, Abb. 3 und ergänzende Tabellen 4 und 5). Das letztgenannte Ergebnis steht im Einklang mit einer Abnahme der Motilität, die für E. coli beschrieben wurde, das sich zu einem Mutualisten bei Stinkbugs entwickelte17, steht jedoch im Widerspruch zu den Erkenntnissen, dass für die Kolonisierungsinitiierung von Zebrafischen und Bobtail-Tintenfischen ein ausreichender Schwarm erforderlich ist18,19. Diese Kontraste sind wahrscheinlich auf Unterschiede in der Symbiontenrekrutierung zwischen den Wirtssystemen zurückzuführen, die entweder durch aquatische Umgebungen für Zebrafische und Tintenfische oder terrestrische Umgebungen für C. elegans und Stinkbugs definiert werden. Darüber hinaus könnten unsere Beobachtungen einer erhöhten Biofilmbildung und einer verringerten Motilität auf einen entwicklungsgeschichtlichen Kompromiss zwischen den Merkmalen, die die Wirtsassoziation definieren, und dem Stadium des freien Lebens hinweisen. Wir kommen zu dem Schluss, dass die experimentelle Evolution in Gegenwart des Nematodenwirts zur Entstehung und Ausbreitung eines Wirtsspezialistentyps führt. Als nächstes fragten wir, ob die verbesserte Wirtsassoziation eine gemeinsame genetische Basis hat.

Die Gesamtgenomsequenzierung der isolierten Morphotypen und des Vorfahren ergab mehrere unabhängige Mutationen in faltigen Wirtsspezialisten, die den bakteriellen Sekundärbotenstoff zyklisches Diguanylat (c-di-GMP) beeinflussen. Insbesondere wurden durch einen Vergleich der nicht stillen genomischen Variation Variantengene identifiziert, die für Spezialisten für faltige Wirte spezifisch sind (Abb. 2a und Ergänzungstabelle 9). Zwei der Gene, wspE und wspF, kodieren für eine Hybridsensor-Histidinkinase bzw. eine Methylesterase im Wrinkly Spreader (wsp)-Operon20. Diese Gene sind Teil eines Zweikomponentensystems, das die c-di-GMP-Spiegel (Abb. 2g) und die Faltenbildung in Beta- und Gamma-Proteobakterien, einschließlich Pseudomonaden, reguliert20,21,22,23. Wir fanden zusätzliche Mutationen, die nur bei den Wirtsspezialisten im Gen rph vorkommen und für RNase PH kodieren, das bisher nicht mit der c-di-GMP-Signalisierung in Verbindung gebracht wurde. Mit einem fluoreszenzbasierten c-di-GMP-Sensor und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) fanden wir einen etwa zweifachen c-di-GMP-Anstieg in drei faltigen Isolaten, jedes mit einer einzelnen Mutation in wspE oder wspF oder rph im Vergleich zum Vorfahren (Abb. 2b, erweiterte Daten Abb. 5 und Ergänzungstabelle 10). Dies deutet auf eine Mutation mit Funktionsverlust in wspF (die c-di-GMP herunterreguliert) und Veränderungen in den aktiven Zentren von WspE und Rph hin, die alle zu einer Hochregulierung von c-di-GMP führen. Wir haben entwickelte und angestammte Aminosäuresequenzen abgeglichen (Extended Data Abb. 6) und eine Störung in den funktionellen Domänen von WspF sowie eine gestörte Empfängerdomäne in WspE bestätigt, die wahrscheinlich dessen Deautophosphorylierung verhindert und somit stromabwärts WspR24 ständig aktiviert. Aminosäuresubstitutionen in der Exoribonuklease-Domäne von Rph verknüpfen seine Ribonukleaseaktivität weiter mit dem c-di-GMP-Metabolismus. Da wir ähnliche Anstiege der c-di-GMP-Spiegel bei anderen Wrinkly-Mutanten, jedoch nicht bei Smooth- oder Fuzzy-Mutanten beobachteten (Extended Data Abb. 5), fragten wir anschließend, ob die Wrinkly-spezifischen Mutationen tatsächlich zu einer verbesserten Wirtsassoziation führen.

a, Übersicht über Gene mit nicht stillen Veränderungen in entwickelten Bakterienisolaten. Datenpunkte stellen mutierte Isolate mit einer oder mehreren Mutationen in einem bestimmten Gen dar (die Gesamtzahl der Isolate mit einer bestimmten Morphologie ist in Klammern angegeben). Ein Kreuz weist auf Gene mit Varianten hin, die in den entwickelten Isolaten im Vergleich zum Vorfahren verloren gegangen sind. b: Fluoreszenzsensor und LC-MS detektierten höhere intrazelluläre c-di-GMP-Konzentrationen in entwickelten Wrinkly-Mutanten im Vergleich zum Vorfahren (Welchs ANOVA und Games-Howell-Post-hoc-Vergleiche, 5 Replikate pro Behandlung). Maßstabsbalken, 10 µm. c, Wettbewerbsfähigkeit (cfus pro Wurm relativ zum Vorfahren, gestrichelte Linie) von entwickelten wspF-, wspE- und rph-Mutanten (links), geretteten Mutanten (Mitte) und rekonstruierten Mutanten im angestammten Hintergrund (rechts) während der Persistenz in C. elegans MY316 (3 < n < 5). d, Wettbewerbsfähigkeit entwickelter wspF-, wspE- und rph-Mutanten während der Persistenz im nicht-nativen C. elegans-Stamm N2 (8 < n < 10). e, Wettbewerbsfitness von wspF-, wspE- und rph-Mutanten (5 < n < 6) mit zusätzlicher ΔwspR-Mutation im Vergleich zum angestammten Pl_MYb11 (gestrichelte Linie). f, Wettbewerbsfitness von wspF, wspE und rph, die heterologe Phosphodiesterase (PDE) PA2133 aus Plasmid (pJN2133) exprimieren, und des angestammten MYb11, das konstitutiv aktive Diguanylatcyclase (DGC) GCN4-WspR aus Plasmid (pJStrep-GCN4-WspR) exprimiert, jeweils im Vergleich zu ihnen jeweilige Leervektorsteuerung (n = 4, gestrichelte Linie). c–f, Persistenzkonkurrenzexperimente wurden mit ≥3 Wiederholungen pro Behandlung durchgeführt und mit ANOVA (d) oder LMM- und FDR-korrigierten Dunnett-Post-hoc-Tests analysiert; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker). g, Grafische Hypothese der adaptiven c-di-GMP-Manipulation über Rph und das Wsp-System. Durchgezogene Linien deuten auf zuvor etablierte regulatorische Wechselwirkungen hin, gestrichelte Linien auf entstehende Hypothesen. Rot zeigt die abgeleiteten Konsequenzen des untersuchten mutierten Gens aus der experimentellen Evolution an.

Eine funktionelle genetische Analyse von wspE, wspF und rph zeigte deren direkte Beteiligung an der Wirtsanpassung. Für diese Analyse haben wir die Konkurrenzfähigkeit von Mutanten im Vergleich zum Vorfahren während der Wirtsbesiedlung beurteilt. Zuerst haben wir die drei ausgewählten faltigen Mutanten erneut bewertet und festgestellt, dass sie deutlich wettbewerbsfähiger sind als der Vorfahre (Abb. 2c, linkes Feld und Ergänzungstabelle 11), außerdem erhöhte Biofilmbildung und verringertes Schwärmen in vitro (Extended Data Abb. 7 und Ergänzungstabelle 12). Danach haben wir diese Mutanten mit den entsprechenden angestammten Allelen gerettet, wodurch die Fitnesssteigerung der Mutanten tatsächlich zunichte gemacht wurde (Abb. 2c, mittleres Feld und Ergänzungstabelle 11). Drittens führte eine experimentelle Einführung jeder Mutation in den Hintergrund der Vorfahren zu einer deutlich höheren Wettbewerbsfähigkeit, zumindest für die wspF- und rph-Mutationen (Abb. 2c, rechtes Feld und Ergänzungstabelle 11). Ein ähnlicher Fitnessvorteil wurde für die wspE- und wspF-Mutanten beobachtet, wenn einer von ihnen einer Quartettkonkurrenz mit dem Vorfahren und den beiden anderen Morphotypen ausgesetzt war (Erweiterte Daten, Abb. 8 und Ergänzungstabelle 13). Bemerkenswerterweise wurden Fitnessvorteile weiterentwickelter Mutanten bei einem nicht-nativen Wirtsstamm (dem C. elegans-Laborstamm N2) durchweg beobachtet (Abb. 2d und Tabelle 14 mit ergänzenden Daten). Während zwei dieser Gene Komponenten des Wsp-Systems sind, das c-di-GMP während der Oberflächenerkennung in anderen Pseudomonaden reguliert, besitzt Pl_MYb11 theoretisch eine Vielzahl von c-di-GMP-modifizierenden Enzymen. Dazu gehören 34 Gene, die für GGDEF kodieren, und 22, die für EAL-Domänen mit mutmaßlichen Diguanylatcyclase (DGC)- bzw. c-di-GMP-spezifischen Phosphodiesterase (PDE)-Funktionen kodieren. Wir haben die Rolle des verwandten DGC des Wsp-Systems bei der Wirtsanpassung mithilfe von WspR-Knockouts in unseren entwickelten Wirtsspezialisten-Mutanten validiert. Diese Änderung machte den Wettbewerbsvorteil der Mutanten im Wirt zunichte (Abb. 2e) und verursachte einen Wechsel von einer faltigen zu einer glatten Koloniemorphologie (Erweiterte Daten, Abb. 7 und Ergänzungstabelle 15), wodurch das DGC-wspR mit wspE und wspF verknüpft wurde (wie erwartet). ) und rph (bisher unbekannt). Darüber hinaus haben wir die c-di-GMP-Spiegel direkt durch heterologe Expression einer PDE und einer DGC aus P. aeruginosa manipuliert, was erwartungsgemäß entweder zu einer verringerten oder verbesserten Persistenz bei C. elegans führte (Abb. 2f, erweitert). Daten Abb. 7 und Ergänzungstabelle 16). Wir kommen daher zu dem Schluss, dass Veränderungen in wspE, wspF und rph, die bei steigenden c-di-GMP-Spiegeln über das Wsp-System zusammenlaufen, die bakterielle Fitness im Wirt verbessern (Abb. 2g). Da die Hochregulierung dieses zweiten Botenstoffs einen grundlegenden Wechsel in der Lebensgeschichte vermittelt, haben wir als Nächstes untersucht, ob er allgemeiner die Wirtsassoziation über Pseudomonaden hinweg vermittelt.

Die genetische Manipulation von wspF und eine bioinformatische Analyse von Pseudomonas-Genomen ergaben eine allgemeine Beteiligung von wsp-Genen an der Wirtsassoziation. Für Ersteres haben wir wspF-Deletionsmutanten für den P. lurida-Stamm MYb193 und den entfernt verwandten P. alkylphenolia MYb187 (beide natürlicherweise mit C. elegans assoziiert) generiert und außerdem den Mutanten- und Wildtyp-P. fluorescens-Stamm SBW25 erhalten, ein Modell für die Faltenbildung21 . Wir fanden heraus, dass die Mutanten im C. elegans-Wirt eine signifikant höhere Wettbewerbsfähigkeit aufwiesen als ihre jeweiligen Wildtypen (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 17). Darüber hinaus korrelierten wir das Vorhandensein von WSP- und RPH-Genen in 1.359 gesamten Pseudomonas-Genomen von NCBI mit der bakteriellen Isolationsquelle, einem Indikator für den Lebensstil (Erweiterte Daten, Abb. 9 und Ergänzungstabelle 18). Pseudomonas-Isolate, die eines der Wsp-Gene oder das vollständige, hochsyntene (Ergänzungstabelle 19)20 Wsp-Operon enthielten, wurden signifikant häufiger aus einem Wirt isoliert als Isolate, denen diese Gene fehlten (Abb. 3b und Ergänzungstabelle 19). Diese Ergebnisse mögen für Gene mit entgegengesetzten regulatorischen Wirkungen (z. B. wspE gegenüber wspF) überraschend erscheinen, werden jedoch wahrscheinlich durch die syntenische Vererbung des gesamten Operons mit seinem Satz interagierender Gene erklärt (Ergänzungstabelle 19; siehe auch Lit. 20). Darüber hinaus war RPH in Isolaten von gesunden/nicht diagnostizierten Wirten häufiger als in Isolaten von erkrankten Wirten. Über alle Lebensstile hinweg haben wir zusätzlich Anzeichen einer negativen Selektion für wspE, wspF und rph festgestellt, was zusätzlich darauf hindeutet, dass sie durch Selektion funktionell stabilisiert werden, wenn sie vorhanden sind (Ergänzungstabelle 20). Wir schlagen vor, dass das Vorhandensein dieser Gene die fein abgestimmte Regulierung von c-di-GMP und damit die Anpassung an einen wirtsassoziierten Lebensstil ermöglicht.

a: Die WspF-Deletion erhöht die Konkurrenzfähigkeit verschiedener Pseudomonas-Arten innerhalb des Wirts im Vergleich zu ihrem Wildtyp (cfus pro Wurm, Wildtyp durch gestrichelte Linie angezeigt; LMM- und FDR-korrigierte Dunnett-Post-hoc-Tests, 3 < n < 5). Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker). b: Das Vorhandensein/Fehlen von wsp-Genen und rph sowie die Vollständigkeit des wsp-Operons (d. h. das Vorhandensein von wspA-F und wspR) variieren mit der Isolationsquelle sequenzierter Pseudomonaden (Χ2-Anpassungstests).

Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass Bakterien ihre Assoziation mit einem Wirt verbessern können, indem sie ihre Lebensgeschichte von einem beweglichen zu einem sessilen, anhaltenden Lebensstil ändern. Diese Änderung des Lebensstils resultiert aus korrelierten Veränderungen in einer Reihe lebensgeschichtlicher Merkmale (Abb. 1f), die zusammen einen Übergang in der lebensgeschichtlichen Strategie darstellen. Eine Möglichkeit, diesen Übergang zu interpretieren, ist eine Verschiebung entlang des r-K-Kontinuums der Lebensgeschichte, von einer r-ähnlichen Strategie, die durch hohe Reproduktionsraten gekennzeichnet ist, zu einer K-ähnlichen Strategie, die durch Persistenz unter Bedingungen hoher Dichte gekennzeichnet ist28,29. Um zu zeigen, ob ein solcher Übergang im Allgemeinen zu einer verstärkten Wirtsassoziation führen würde, verwendeten wir eine Erweiterung eines zuvor veröffentlichten mathematischen Modells der mikrobiellen Evolution in Richtung Wirtsassoziation30. Die Untersuchung eines breiten Parameterraums mit diesem Modell bestätigte, dass eine erhöhte Persistenz innerhalb des Wirts häufig die optimale Strategie für die mikrobielle Anpassung an Wirte ist (Erweiterte Daten, Abb. 10 und ergänzende Diskussion), was darauf hindeutet, dass die Ergebnisse unserer Studie möglicherweise allgemein anwendbar sind.

In unseren Experimenten wird die Änderung des Lebensstils von primär freilebend zu wirtsassoziiert durch das Wsp-System und anschließend durch die Aktivität des bakteriellen sekundären Botenstoffs c-di-GMP vermittelt. Es ist bekannt, dass C-di-GMP wichtige physiologische Funktionen in Bakterien reguliert, einschließlich der Regulierung der Virulenz bei bakteriellen Krankheitserregern22,31. Unsere Arbeit zeigt, dass dieses Regulierungssystem die Anpassung von Pseudomonaden an verschiedene Wirtssysteme, von Pflanzen bis hin zu Menschen, fördert, und zwar nicht nur bei Krankheitserregern, sondern auch bei nützlichen Wirt-Bakterien-Beziehungen. Angesichts der Bedeutung nützlicher Mikroorganismen für das Funktionieren ihrer Wirte ist das Verständnis der Mechanismen, die nicht-pathogene Assoziationen vermitteln, von entscheidender Bedeutung. Unsere Studie legt nahe, dass c-di-GMP in vielen dieser Assoziationen eine wesentliche Rolle spielt.

Wir führten Evolutionsexperimente mit dem P. lurida-Stamm MYb11 (Pl_MYb11) und seinem natürlichen Wirtsstamm C. elegans MY316 (Ce_MY316) durch (Lit. 5). Zur Vorbereitung aller Experimente haben wir gefrorene Wurmbestände (–80 °C) aufgetaut und Würmer auf Nematoden-Wachstumsmedium-Agar (NGM32) gezüchtet, der mit E. coli OP50 besät war. In zusätzlichen Experimenten zur Persistenzkolonisierung verwendeten wir den Standardlaborstamm C. elegans N2 als nicht-nativen Wirt für die entwickelten Bakterien. Ein Standardbleichprotokoll wurde verwendet, um sterile und synchronisierte L1-Larven zu sammeln, die dann auf E. coli OP50 (20 °C) auf das L4-Stadium gebracht wurden, sofern nicht anders angegeben.

Die P. lurida-Stämme MYb11 und MYb193 sowie P. alkylphenolia MYb187 wurden aus Ce_MY316 (Lit. 5) und P. fluorescens SBW25 aus Zuckerrübenblättern isoliert9. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Bakterien auf Trypsin-Soja-Agar (20 °C, 48 Stunden) und Trypsin-Soja-Brühe (28 °C, 150 U/min, über Nacht) kultiviert.

Bakterienpopulationen, die aus einem Klon von Pl_MYb11 stammten, wurden seriell auf NGM in Gegenwart von Ce_MY316 (Wirtsbehandlung, 6 Replikate) oder ohne Würmer (Negativkontrolle, 6 Replikate) passagiert. Für jede Wiederholung wurde ein Rasen von Pl_MYb11 auf NGM ausgesät und 3,5 Tage lang kultiviert. Für jeden Zyklus der Wirtsbehandlung wurden 10 C. elegans L4-Larven pro Platte hinzugefügt und inkubiert, bis die Würmer die F1-Generation erreichten (3,5 Tage). Bei den Negativkontrollen wurden die Bakterien ohne Würmer auf NGM gehalten. Am Ende jedes Zyklus wurden Bakterien entweder von Würmern oder Platten in der wirtsassoziierten bzw. Kontrollbehandlung gesammelt, 10 % der Population (Engpass) wurden in den nächsten Zyklus übertragen und eine Probe eingefroren (–80 °C). . Eine ähnliche Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) wurde verwendet, um die Negativkontrolle zu begrenzen. Insgesamt wurden 10 Zyklen durchgeführt.

Gefrorene Bakterien aus Zyklus 10 wurden gewonnen und vor der Durchführung weiterer Experimente einem weiteren Zyklus des Evolutionsexperiments unterzogen, um mögliche selektive Auswirkungen des Einfrierens/Auftauens zu minimieren. Um sich auf die entwickelten Unterschiede zwischen Populationen der Wirtsbehandlung und der Negativkontrolle zu konzentrieren und nicht auf physiologische Reaktionen auf die jüngste Wirtsexposition, wurden Bakterien zwei Tage lang als übliche Gartenbehandlung auf NGM gezüchtet und dann in nachfolgenden Tests verwendet.

Die bakterielle Fitness während der Wirtsassoziation wurde als KBE pro Wurm quantifiziert. Zur Vorbereitung wurden Bakterienrasen (125 µl, optische Dichte (OD)600 = 2) auf NGM ausgesät und 5 synchronisierte L4 Ce_MY316 hinzugefügt. Nach 3,5 Tagen bei 20 °C wurden die Würmer mit M9-Puffer gesammelt, der 0,025 % Triton-100 und 25 mM des lähmenden Antihelminthikums Tetramisol enthielt. Die Würmer wurden mit einem speziell angefertigten Filterspitzenwaschsystem33 in Puffer gewaschen und in M9 mit Triton-100 gesammelt. Als Hintergrundprobe wurde wurmfreier Überstand gesammelt. Nach der Homogenisierung durch Perlenschlagen wurden Reihenverdünnung und Ausplattieren zur Quantifizierung der KBE verwendet. Der KBE pro Wurm wurde als Differenz der KBE zwischen Wurm- und Überstandsproben, dividiert durch die Anzahl der Würmer pro Population, berechnet. Für diversifizierte Populationen wurden die Koloniemorphologien als glatt, unscharf oder faltig bewertet.

Das Wachstum der Wurmpopulation aus 5 L4-Larven über 3,5 Tage wurde als Indikator für die Fitness des Wirts quantifiziert. Bakterien und Würmer wurden wie für Kolonisierungstests vorbereitet und die gewaschenen Würmer in Platten mit 48 Vertiefungen eingefroren. Fotos von Würmern wurden automatisch in ImageJ2 ausgewertet (Ref. 34): Würmer wurden als Partikel erkannt, die durch Ellipsen angenähert wurden, und solche, die C. elegans-ähnlichen Abmessungen entsprachen (Hauptachse 0,18–1,3 mm, Nebenachse ≤ 0,1 mm (Ref. 35). )) wurden gezählt. Die Erkennungsqualität wurde durch Korrelation der automatischen Wurmzählungen mit den Zählungen zweier unabhängiger Experimentatoren validiert (r(58) = 0,736, P = 2,106 × 10−11).

Um die frühe Besiedlung, Persistenz und Freisetzung von Würmern im L4-Stadium zu quantifizieren, wurden Bakterienrasen aus angestammtem Pl_MYb11 und entwickelten Populationen (Post-Common-Garden) oder klonalen Morphotypen (Übernachtkulturen) hergestellt. In frühen Kolonisierungstests haben wir Bakterien quantifiziert, die in L4 Ce_MY316 eingedrungen sind und zuvor auf nicht kolonisierendem E. coli O50 gezüchtet wurden. Anschließend wurden die Kolonisierungsgrade wie oben getestet, was zu KBE pro Wurm als Maß für die frühe Kolonisierung führte.

Für Persistenz- und Freisetzungstests wurden Würmer auf den jeweiligen Testbakterien (vom L1- bis zum L4-Stadium) gezüchtet, wodurch die Entwicklung von Würmern in der F1-Generation des Evolutionsexperiments nachgeahmt wurde. Anschließend wurden die Würmer gesammelt, mit dem Filterspitzen-Waschsystem gewaschen und die Proben in Überstand (Überstand 1) und Wurmprobe (jeweils 100 µl) aufgeteilt. Anschließend wurden die Würmer in 200 µl M9 suspendiert und 1 Stunde lang inkubiert. Anschließend wurden 100 µl Überstand mit freigesetzten Bakterien (Überstand 2) gesammelt. Die pro Wurm freigesetzten cfus wurden anhand der Differenz der cfus zwischen Überstand 2 und Überstand 1 bestimmt. Darüber hinaus haben wir die in den Würmern dieser Probe erhaltenen cfus als Maß für die Persistenz quantifiziert.

Um das Bakterienwachstum zu messen, wurden Bakterienpopulationen (übliche Gartenbehandlung oder Übernachtkulturen) auf OD600 = 0,1 eingestellt und 50 µl auf NGM getupft. Nach der Inkubation (24 Stunden oder 3 Tage bei 20 °C) wurden die Rasenflächen abgekratzt, homogenisiert und der KFU durch Reihenverdünnung bestimmt.

Die Ausbreitung und das Schwärmen der Kolonien wurden auf NGM mit 0,5 % bzw. 3,4 % Agar getestet. In beiden Fällen wurden 0,5 µl Zellsuspension (OD600 = 1) auf oberflächengetrocknete Agarplatten getüpfelt. Der Koloniedurchmesser wurde nach 24 Stunden, 3 und 7 Tagen gemessen.

Die In-vitro-Biofilmbildung wurde in Mikrotiterplatten wie zuvor beschrieben getestet36. Insbesondere wurden die Tests in einem randomisierten Layout auf oberflächenbehandelten Nunclon Delta-Platten durchgeführt. Die Färbung erfolgte nach 48-stündiger Inkubation (20 °C, Orbitalschütteln bei 180 U/min). Die Absorption gefärbter Biofilmlösungen wurde bei 550 nm mit einem Gen5-Mikroplattenlesegerät und einer Imager-Software (Biotek, Version 3.08.01) gemessen. Um die Biofilmbildung in Flüssigkeit zu veranschaulichen, wurden Glasreagenzgläser mit 2 ml tryptischer Sojabrühe gefüllt, mit einzelnen Kolonien des angestammten Pl_MYb11 oder entwickelten Wirtsspezialmutanten (wspE, wspF, rph) beimpft und bis zur Fotografie 48 Stunden lang bei 20 °C inkubiert .

Repräsentative Kolonien mit visuell unterschiedlichen Morphologien wurden aus entwickelten Populationen des Zyklus 10 isoliert. Die entwickelten Populationen wurden aufgetaut, seriell verdünnt und ausplattiert (48 Stunden, 20 °C). Einzigartige Morphotypen aus allen entwickelten Populationen wurden erneut gestrichen und als gefrorene Bestände archiviert (Ergänzungstabelle 3). Alle Morphotypen wurden einmal aufgetaut und erneut ausgestrichen und zeigten während der zweitägigen Inkubation eine stabile Koloniemorphologie.

Makrokolonien von Pl_MYb11-Morphotypen und -Mutanten wurden wie zuvor beschrieben hergestellt37. Kurz gesagt, 5 µl der Übernachtkultur wurden auf tryptische Soja-Agarplatten, ergänzt mit 40 µg ml-1 Kongorot, getüpfelt und bei 20 °C inkubiert. Nach 24 Stunden oder 48 Stunden wurden Fotos mit einem Leica-Fluoreszenzpräpariergerät (LEICA M205 FA) aufgenommen.

Der faltige Morphotyp MT12 wurde mit rot fluoreszierendem dTomato (dT) unter Verwendung einer Tn7-Transposon-basierten chromosomalen Insertion wie zuvor beschrieben markiert38,39. Das Einfügen der Markierung hatte keinen Einfluss auf die faltige Morphologie der Kolonien.

Fluoreszierend markiertes MT12 wurde verwendet, um die Kolonisierung in Ce_MY316 mithilfe konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (ZEISS LSM 880) zu lokalisieren. Zu diesem Zweck wurden synchronisierte Larven im L1-Stadium 72 Stunden lang (20 °C) markierten Bakterien ausgesetzt, dann mittels Schwerkraftwäsche gesammelt und wie zuvor beschrieben für die Mikroskopie montiert39. Übersichten über vollständige Würmer wurden in beiden Fällen mit einem ×25 LD LCI Plan-Apochromat-Mehrfachimmersionsobjektiv (numerische Apertur (NA) = 0,8) erstellt und Details mit einem ×40 C-Apochromat-Wasserimmersionsobjektiv (NA = 1,2) abgebildet unter Verwendung von Immersol W (2010) mit einem Brechungsindex von 1,334. Bakterienfluoreszenz und Wurmautofluoreszenz wurden nacheinander angeregt (561 nm und 488 nm) und mit einem Airyscan-Detektor (RS-Empfindlichkeitsmodus; Langpassfilter ≥570 nm; Bandpassfilter 495–550 nm) nachgewiesen. Die Daten wurden mit der automatischen Airyscan-Verarbeitungsfunktion von ZEISS Efficient Navigation 2 verarbeitet. Eine Liste der in dieser Studie verwendeten genetisch veränderten Bakterien finden Sie in der Ergänzungstabelle 21. Nach Betrachtung der Besiedlung von >10 Würmern in mindestens 3 biologischen Replikatpopulationen von In aufeinanderfolgenden Wochen der Experimente wurde ein repräsentativer Wurm für Abb. 1e und Extended Data Abb. 2 abgebildet.

Die Gesamt-DNA wurde unter Verwendung eines auf Cetyl-Trimethylammoniumbromid basierenden Protokolls40 isoliert. Für die Illumina MiSeq-Sequenzierung (Paired-End, 300 bp) wurden Bibliotheken mit dem Nextera DNA Flex-Kit vorbereitet. Die Lesequalität wurde mit FastQC (v.0.11.8) (Ref. 41) überprüft und die Lesewerte mit Trimmomatic (v.0.3.9) (Ref. 42) getrimmt. Gepaarte Lesevorgänge wurden mit dem Pl_MYb11-Referenzgenom (RefSeq: GCF_002966835.1; Bowtie2 v.2.3.3 (Ref. 43)) abgeglichen und doppelte Regionen mit Picardtools (v.2.22.2) (Ref. 44) entfernt. Varianten wurden mit BCFtools (v.1.10.2) (Ref. 45) und VarScan (v.2.3.9) (Ref. 46) aufgerufen und dann mit Anmerkungen versehen (snpEff47,48). Wir haben nach nicht-synonymen Varianten gefiltert, die in der Ahnenkontrolle in R49,50 nicht vorhanden sind. Die Genontologie wurde mithilfe von Pseudomonas.com51 abgeleitet. Um auf Gene zu schließen, die für Enzyme mit mutmaßlicher DGC- oder PDE-Aktivität kodieren, haben wir mithilfe des InterProScan der Conserved Domains Database (CDD) über Pseudomonas.com51 nach Proteinen mit GGDEF- und EAL-Domänen gesucht.

Um Aminosäuresequenz-Alignments von angestammtem und mutiertem WspE, WspF und RPH vorzubereiten, wurden Nukleotidsequenzen mit EMBOSS Transeq52 (Rahmen 1; bakterielle Codon-Tabelle; vorwärts für wspE und wspF, rückwärts für rph) translatiert und die resultierenden Aminosäuresequenzen mit Clustal Omega52 ausgerichtet (v.1.2.4; ClustalW mit Zeichenanzahl und Standardeinstellungen). Zur Annotation und Visualisierung von Proteindomänen wurden Domänenvorhersagen der jeweiligen Sequenzen von Pfam/InterPro (Quelle: Pseudomonas.com51) gesammelt und in mit DOG (v.2.0)53 erstellten Proteinvisualisierungen visuell hervorgehoben.

Um die intrazellulären Konzentrationen von c-di-GMP in Pl_MYb11 der Vorfahren und weiterentwickelten faltigen Isolaten (MT12: wspFEVO, MT14: wspEEVO und MT22: rphEVO) zu quantifizieren, verwendeten wir einen etablierten Biosensor auf Plasmidbasis54. Bakterienstämme, die das Plasmid trugen, wurden auf Gentamicin-selektiven Platten gezüchtet (70 h, 20 °C). Für die Mikroskopie wurden einzelne Kolonien in 1X PBS resuspendiert, auf 2 % Agarose-Pflaster auf Objektträgern aufgetragen und versiegelt.

Die bakterielle Fluoreszenz wurde mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (ZEISS LSM 700 mit ×40 Plan-Apochromat-Ölimmersionsobjektiv (NA = 1,4) und Immersol 518F mit einem Brechungsindex von 1,518) sichtbar gemacht. Die Fluoreszenz des Sensors und des Normalisierers wurde nacheinander angeregt (555 nm und 488 nm) und mit einem Photomultiplier-Röhrendetektor und einem variablen sekundären dichroitischen Transmissionslicht mit Wellenlängen ≤630 nm bzw. ≤550 nm nachgewiesen. Die Anregungs- und Detektionseinstellungen wurden bei allen Messungen identisch gehalten.

Die Fluoreszenzintensität pro Zelle wurde in Bild J34 gemessen: Alle Zellen und fünf Hintergrundbereiche wurden als interessierende Regionen identifiziert und Fläche, integrierte Dichte und mittlere Grauwerte wurden gemessen. Daten aus den nicht transformierten Bildern wurden zur Berechnung der korrigierten Gesamtzellfluoreszenz55 verwendet.

Zusätzlich zu Einzelzellmessungen haben wir c-di-GMP auf Populationsebene quantifiziert. Hierzu wurden Kolonien von entwickelten faltigen (MT12, MT21, MT25, MT26), glatten (MT13, MT33) und flockigen (MT11) Isolaten wie oben beschrieben gezüchtet, in 1X PBS resuspendiert und auf OD600 = 0,1 eingestellt. Zellsuspensionen (200 µl) wurden dann in dreifacher Ausfertigung auf schwarze 96-Well-Platten mit flachem Boden und transparentem Boden (Greiner Bio-One CELLSTAR 96-Well, zellkulturbehandelt) übertragen. Nach dem Schütteln (10 s, orbitales Schütteln bei 1 mm Amplitude) wurde die Fluoreszenz nacheinander angeregt (454 nm und 460 nm, Bandbreite 9 nm, 10 Blitze) und die Emission nachgewiesen (585 nm und 510 nm, Bandbreite 20 nm; optimale Verstärkung, 20). µs-Integration) in einem Plattenlesegerät (Tecan, Infinite M200Pro), wobei 1X PBS als Hintergrundkontrolle dient.

Um auf die c-di-GMP-Konzentration zu schließen, berechneten wir die relative Fluoreszenzintensität oder das Verhältnis zwischen TurboRFP- und AmCyan-Fluoreszenzintensitäten, wie zuvor beschrieben 54, und verglichen die durchschnittlichen relativen Fluoreszenzintensitäten zwischen Pl_MYb11 der Vorfahren und weiterentwickelten faltigen, glatten und unscharfen Morphotypen. Für die in Abb. 2 verwendeten Bilder wurde eine lineare LUT im gesamten Bereich verwendet. Helligkeit und Kontrast wurden auf alle Bilder gleichermaßen angewendet.

Um intrazelluläres c-di-GMP mittels LC-MS im parallelen Reaktionsüberwachungsmodus zu quantifizieren, wurden angestammtes und entwickeltes Pl_MYb11 (MT12, MT14 und MT22) in LB-Medium bis zu einer OD600 von 1,8 gezüchtet und durch Zentrifugation pelletiert. Nach dem Waschen mit salzfreiem LB-Medium wurden pelletierte Zellen schockgefroren und gelagert (–80 °C). Die Zellen wurden mit 10 pmol internem Standard (cyclisches Di-GMP-13C20,15N10, Toronto Research Chemicals) in 60 μl Wasser gemischt. Die Extraktion von c-di-GMP wurde wie zuvor beschrieben56 mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Extraktionslösung (240 μl 1:1 Acetonitril (ACN)/Methanol (MeOH)) wurde zugegeben und die Proben wurden kräftig gevortext. Nach Inkubation auf Eis (15 Min.) und Zentrifugation (20.800 × g, 4 °C, 2 Min.) wurde der Extraktüberstand gesammelt und die Lösungsmittelextraktion zweimal wiederholt (200 μl 2:2:1 ACN/MeOH/Wasser). Die gepoolten Extrakte wurden getrocknet, in 50 μl Wasser resuspendiert und zentrifugiert, um unlösliche Verbindungen zu entfernen. Die Konzentrationen solubilisierter Proteinniederschläge wurden mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) bestimmt. Für LC-MS/MS wurde 1 μl Extrakt auf ein EASY-nLC 1000 UHPLC (Thermo Fisher) injiziert und auf einer 15-cm-ReproSil-Pur C18-AQ nano LC-Säule (0,1 mm ID, 1,9 μm, 120 Å) aufgetrennt. Altmann Analytik) bei 400 nl min−1. Eluent A war 10 mM NH4OAc mit 0,1 % HAc, Eluent B war 100 % MeOH. Die chromatographischen Bedingungen waren 5 % Eluent B (5 Min.), gefolgt von einem linearen Gradienten von 5 % auf 20 % B (15 Min.) und einem Anstieg auf 70 % B (1 Min.), gefolgt von 70 % B (5 Min.) und 5 % B (5 Min.); Die Kollisionsdissoziation bei höherer Energie der Vorläufer m/z 691,1021 und m/z 721,0714 wurde auf einem Q Exactive HF Orbitrap MS (Thermo Fisher) durchgeführt. Peakflächen für die qualifizierenden57 Produktionen m/z 248,0778 (leicht) und m/z 263,0965 (schwer), ermittelt in Skyline (v.21.1.0.146.3, MacCoss Lab-Software)58, wurden zur Berechnung der gesamten c-di-GMP-Mengen verwendet , die auf die durch den BCA-Assay erhaltene Gesamtproteinmenge normalisiert wurden.

Eine zweistufige Allelaustauschmethode basierend auf zuvor beschriebenen Protokollen21,59 wurde verwendet, um die entwickelten mutierten Allele in einen angestammten Hintergrund einzuführen und auch Mutationen durch Einführung angestammter Allele in den mutierten Hintergrund rückgängig zu machen. Wir haben die folgenden Modifikationen vorgenommen: ~700 bp lange PCR-Amplifikate rund um jede Mutation wurden in pUISacB kloniert, um eine Saccharoseselektion zu ermöglichen. Die Konstrukte wurden in kompetente E. coli-Zellen transformiert und durch konjugative Paarung mit einem E. coli-Helferstamm, der pRK2013 enthielt, auf Pseudomonas-Isolate übertragen (Lit. 60). Primer (siehe Ergänzungstabelle 22) wurden mit dem BLAST-Tool61 und dem NCBI-Primer-BLAST62, NEBuilder v.2.3.0 (New England Biolabs) und dem Oligo Analyze Tool (Eurofins Genomics) von NCBI entworfen. BLASTn und Alignments mit Clustal Omega63 wurden mit Standardeinstellungen durchgeführt.

Um die intrazellulären c-di-GMP-Spiegel zu manipulieren und die Konsequenzen für die Wirtsassoziation und Koloniemorphologie zu untersuchen, exprimierten wir eine heterologe PDE und eine heterologe DGC in unseren entwickelten Wirtsspezialisten-Mutanten (wspE, wspF und rph). Die PDE PA2133 von P. aeruginosa wurde vom Plasmid pJN2133 exprimiert (Lit. 23). Ein konstitutiv aktives GCN4-WspR-Fusionskonstrukt27 wurde synthetisiert (Eurofins) und dann in pJStrep kloniert, um ein C-terminales StrepII-markiertes GCN4-WspR-Konstrukt zu erzeugen. Als Kontrollen wurden leeres pJStrep (ein modifizierter pJN105-Vektor (Ref. 64), der die StrepII-Tag-Kodierungssequenz enthält) und leere pJN105-Plasmide verwendet. Alle Plasmide wurden in Pl_MYb11 eingeführt und entwickelten Mutanten unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Elektroporationsprotokolls65.

Konkurrenzexperimente wurden wie für die Kurzzeit-Persistenztests beschrieben durchgeführt. Co-inokulierte Bakterien wurden OD-angepasst und in gleichen Volumina gemischt, bevor sie als Rasen auf NGM-Agar ausgesät wurden. Es wurde ein mit dTomato39 markiertes Pl_MYb11 verwendet, das dem angestammten Pl_MYb11 entspricht, da keine Unterschiede in der Kurzzeitpersistenz beobachtet wurden (Varianzanalyse (ANOVA), F-Wert = 0,99, df = 1, P = 0,35). Die KBE pro Wurm wurden bestimmt, indem die KBE in den Überständen von denen in Wurmproben abgezogen wurden. Ein Konkurrenzindex wurde als Verhältnis von KBE pro Wurm entwickelter oder konstruierter Mutanten zu KBE pro Wurm des Vorfahren berechnet.

Gesamtgenomsequenzen von NCBI wurden nach c-di-GMP-modulierenden Genen (Schwerpunkt: wsp-Operon, rph) mit bakteriellem Lebensstil in Mitgliedern der Gattung Pseudomonas durchsucht. Zunächst wurden Kandidatengenome erhalten (Befehlszeilensuchtool von NCBI Nucleotide; Größe: 5–8 Millionen bp). Dadurch wurden 2.279 Sequenzen abgerufen, für die Probeninformationen aus der Biosample-Datenbank des NCBI gesammelt wurden. Sofern verfügbar, wurden Wirt, Wirtskrankheitsstatus, Isolationsquelle und Probentyp verwendet, um Genome manuell als von frei lebenden oder wirtsassoziierten Isolaten mit oder ohne/unbekannter Krankheit stammend zu klassifizieren (Ergänzungstabelle 18). Als nächstes haben wir alle verfügbaren Pseudomonas-Referenzsequenzen für rph- und wsp-Gene von pseudomonas.com51 heruntergeladen. Diese wurden verwendet, um Kandidatensequenzen von rph, wspA, wspB, wspC, wspD, wspE, wspF und wspR zu identifizieren. Diese Zielgenkandidaten wurden mithilfe von BLAST (R-Paket „rBLAST“) in den ausgewählten Genomen gefunden und anhand der Sequenzlängen und prozentualen Identitäten der BLAST-Treffer gefiltert (Extended Data Abb. 9). Prozentuale Identität und Sequenzlänge wurden ausgewählt, um die Chance zu maximieren, dass Gene korrekt identifiziert wurden (rote Rechtecke in Extended Data Abb. 9). Wenn bei BLAST-Suchen mit den Referenzgenen als Abfrage mindestens ein Kandidatengen identifiziert wurde, wurde dieses Gen als im jeweiligen Genom vorhanden angesehen. Anschließend verwendeten wir χ2-Anpassungstests, um abzuleiten, ob sich Isolate mit und ohne Zielgene in den relativen Anteilen der wirtsassoziierten Lebensstile unterschieden (Ergänzungstabelle 19).

Um zu beurteilen, ob unsere zentralen Wirtsspezialisten-Gene (wspE, wspF, rph) eine positive oder reinigende Selektion in der Gattung Pseudomonas erlebten, führten wir MUSCLE-Codon-basierte Mehrfachsequenz-Alignments von Nukleotidsequenzen (siehe oben beschriebenen Datensatz) unter Verwendung von MEGA11 durch (Ref. 66; Standardeinstellungen). Anschließend führten wir codonbasierte Z-Tests (Standardeinstellungen) durch, um signifikante Abweichungen von der neutralen Selektion zu testen. Darüber hinaus analysierten wir Selektionssignaturen in Blast-Hits für einen Satz von drei Pseudomonas-Kerngenen (gyrB: PA0004, rpoD: PA0576 und eine 16S-rRNA-Methyltransferase: PA0419; siehe auch Lit. 67) in dem für wsp und untersuchten Genomsatz rph-Anwesenheit/-Abwesenheit, auch unter Verwendung mehrerer Sequenz-Alignments und Codon-basierter Neutralitätstests.

Vor der Datenerhebung wurden keine statistischen Methoden zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen verwendet, aber unsere Stichprobengrößen ähneln denen in früheren Veröffentlichungen. In allen Experimenten wurden Behandlungen und Proben verblindet und randomisiert. Vor der Datenanalyse wurden die Annahmen parametrischer Modelle (Normalität, Homogenität der Varianzen) durch visuelle Inspektion (Box-/qqplots) und mit Shapiro-Wilk- und Levene-Tests überprüft. Wenn diese nicht erfüllt waren, wurden nichtparametrische Tests angewendet. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), obere/untere Quartile (Boxgrenzen) und 1,5-fache Interquartilbereiche (Whisker).

Um zu überprüfen, ob sich entwickelte Populationen in cfus pro Wurm vom Vorfahren unterschieden, verglichen wir die Verschiebung des weiterentwickelten Phänotyps (Verhältnis von cfus pro Wurm der entwickelten Populationen zu denen des angestammten Pl_MYb11) mit dem angestammten Phänotyp unter Verwendung von t-Tests bei einer Stichprobe (Alpha). = 0,05, mu = 1) mit Korrektur der Falscherkennungsrate (FDR68) für mehrere Tests. Wir haben diesen Ansatz angewendet, um Folgendes zu analysieren: bakterielle Besiedlung einzelner Würmer, Wachstum der Wurmpopulation, frühe Besiedlung, Persistenz und Freisetzung, Kolonievergrößerung und -schwärmung. Um allgemeine phänotypische Verschiebungen entsprechend der evolutionären Behandlung abzuleiten, wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) einschließlich der getesteten Phänotypen durchgeführt. Wir führten eine Permutationsanalyse der Varianzen (PERMANOVA, 1.000 Permutationen) durch, gefolgt von paarweisen Vergleichen von Gruppen (FDR-korrigiert), um Unterschiede in den Phänotypsätzen von Ahnen- und Evolutionsgruppen zu testen, und zeichneten Konfidenzellipsen auf (eine Standardabweichung). Zu den verwendeten Paketen gehörten ggbiplot69, missMDA70, vegan71 und pairwise.adonis72.

Unterschiede in den Anteilen der verschiedenen Koloniemorphologien (faltig, glatt und unscharf) innerhalb von Würmern wurden mithilfe verallgemeinerter linearer Modelle (GLM; Quasinormalverteilung) mit Tukey-Post-hoc-Tests (unter Verwendung von lme4 (Lit. 73), lmtest74 und multcomp75) identifiziert.

Änderungen der Morphotyp-Proportionen im Laufe der Zeit wurden mithilfe von Beta-Regressionen (unter Verwendung von gamlss76) getestet.

Unterschiede zwischen Morphotyp-Phänotypen wurden mithilfe von ANOVA oder GLMs festgestellt, gefolgt von Tukey- oder Dunnett-Post-hoc-Tests. Um funktionelle Spezialisierungen über Phänotypen hinweg abzuleiten, verwendeten wir PCA und PERMANOVA.

Unterschiede in der Biofilmbildung und -motilität zwischen entwickelten Faltenwirtsspezialisten (wspE-, wspF- und rph-Mutanten) und dem angestammten Pl_MYb11 wurden mithilfe verschachtelter ANOVAs und anschließender Tukey-Post-hoc-Tests analysiert. Wenn keine Batch-Effekte (entwickelte Ursprungspopulation) festgestellt wurden, wurden Mutanten zwischen den Populationen verglichen. Im Fall der Schwarmdurchmesser wurde die rph-Mutante jedoch mithilfe eines t-Tests mit dem mitanalysierten Vorfahren Pl_MYb11 verglichen.

Unterschiede in den c-di-GMP-Konzentrationen zwischen entwickelten Isolaten wurden mithilfe der Welch-ANOVA, der verschachtelten ANOVA oder der ANOVA mit Games-Howell- oder Dunnett-Post-hoc-Vergleichen abgeleitet.

Wir haben Unterschiede in den KBE pro Wurm zwischen Morphotypen oder Mutanten mithilfe von GLMs und linearen gemischten Modellen (LMMs) sowie Post-hoc-Vergleichen mit Dunnett oder Tukey getestet.

Alle Analysen und Darstellungen wurden in R49,50,77,78 durchgeführt.

Wir haben ein Modell erstellt, um den Selektionsgradienten zu bewerten, den Bakterien während des Evolutionsexperiments erfahren (Extended Data, Abb. 10). Wir haben uns auf die Phase konzentriert, in der Bakterien mit Würmern in Kontakt kommen, und eine homogene Population betrachtet. Die Dynamik der Anzahl der in (irgendeinem) Wirtsverband lebenden Bakterien n(t) kann durch die Gleichung beschrieben werden

wobei W(t) die Biomasse der Würmer auf der Platte zum Zeitpunkt t bezeichnet. Wir gehen davon aus, dass die Bakterien auf der Platte, wenn sie bis zur Sättigung wachsen, immer im Übermaß vorhanden sind, so dass nur die Anzahl der Würmer und die Geschwindigkeit f, mit der sie sich von Bakterien ernähren, die Einwanderung frei lebender Bakterien in den Wirt begrenzen. Wir gehen von einem logistischen Wachstum der Bakterienpopulation innerhalb der Würmer aus, mit einer maximalen Rate r und einer Tragfähigkeit proportional zur Biomasse der Würmer W(t) und der Tragfähigkeit K pro Einheit der Wurmbiomasse. Schließlich ein Bruchteil der wirtsassoziierten Die Bakterienpopulation wird mit einer Geschwindigkeit δ vom Wirt entfernt, was den Tod der Bakterien und deren Ausstoß in die Umwelt umfasst. Wie im Evolutionsexperiment gehen wir davon aus, dass nur wirtsassoziierte Bakterien ausgewählt werden und mit dem nächsten Zyklus fortfahren, wobei wir die Dynamik auf der Platte ignorieren. Wir gehen von einem linearen Wachstum der Wurmbiomasse aus, W(t) = gt + W0, das sowohl Reproduktion als auch Entwicklung umfasst. Wir vernachlässigen die mögliche Entwicklung vorteilhafter Auswirkungen auf das Wurmwachstum und legen die Parameter W0 = 10 und g = 711 d−1 auf experimentell beobachtete Werte fest.

Wir haben untersucht, wie die endgültige Anzahl wirtsassoziierter Bakterien, nf, durch Änderungen der Parameter beeinflusst wird, die den bakteriellen Lebenszyklus beschreiben (r, δ, f, K). Wir haben für jeden dieser Parameter (d. h. den Merkmalsraum) eine Reihe biologisch plausibler Werte definiert, die nach Möglichkeit auf experimentellen Daten basieren:

10−1 d−1 < r < 101,25 d−1, d. h. zwischen einem kleinen Bruchteil und etwa dem Doppelten der maximalen Wachstumsrate auf der Platte (~7 d−1).

10−0,5 d−1 < δ < 104 d−1, da die typische Zeit, in der ein Wurm 50 % seines Mikrobioms verliert (ohne Nahrungsaufnahme und Replikation), zwischen Sekunden und Tagen liegen sollte.

104 < K < 106,25, angesichts der Größenordnungen der experimentell gemessenen maximalen Bakterienzahl pro Wurm (~105).

103 d−1 < f < 107,5 d−1, da die typische Zeit für die Kolonisierung eines leeren Wurms mit 10 % seiner Tragfähigkeit (K = 105) zwischen Sekunden und Tagen variieren sollte, wobei die Bakterienfreisetzung und die Replikation innerhalb des Wirts vernachlässigt werden .

Für jeden Punkt des Merkmalsraums haben wir Gleichung (1) numerisch gelöst, um die erwartete endgültige Anzahl von Bakterien bei tf = 3,5 d, nf = n(tf) zu berechnen. Schließlich haben wir die Elastizität von nf entlang jeder Richtung des Merkmalsraums bewertet, die die erwartete relative Änderung von nf in Bezug auf eine kleine relative Änderung in einem der Merkmale misst. Wir interpretierten den Vektor der Elastizitäten als Selektionsgradienten der phänotypischen Merkmale79 und nutzten das dominante Element dieses Vektors, um eine „optimale Evolutionsstrategie“30 für jeden Punkt des Merkmalsraums zu definieren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohe Sequenzierungsdaten sind beim NCBI unter Bioproject PRJNA862108 verfügbar. Alle anderen Daten sind unter https://github.com/nobeng/c-di-GMP_host-association zugänglich.

Benutzerdefinierter Code und zugehörige Daten sind unter https://github.com/nobeng/c-di-GMP_host-association verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken E. Stukenbrock (Universität Kiel, Deutschland) für den Zugang zum LSM 880; K. Guillemin (University of Oregon, Eugene, USA), P. Rainey (Max-Planck-Institut für Evolutionsbiologie, Plön, Deutschland), H. Schweizer (Northern Arizona University, USA), F. Yildiz (University of California). Santa Cruz, Vereinigte Staaten) und G. O'Toole (Dartmouth Medical School, Vereinigte Staaten) für die Bereitstellung von Bakterienstämmen oder Plasmiden; D. Rogers, J. Summers (beide Max-Planck-Institut für Evolutionsbiologie, Plön, Deutschland) für Anleitungen zum Allelaustausch; J. Zimmermann (Gruppe Schulenburg, Universität Kiel, Deutschland) für bioinformatische Unterstützung; B. Pees (Schulenburg-Gruppe, Universität Kiel, Deutschland) für Illustrationsunterstützung; S. Joel, J. Hofmann, J. Löwenstrom, J. Lorenzen, H. Griem-Krey, L. Bluhm und L. Rheindorf (alle Schulenburg-Gruppe, Universität Kiel, Deutschland) für Laborunterstützung; das Kieler BiMo/LMB für den Zugang zu ihren Kerneinrichtungen; das Schulenburg-Labor für Projekt-Feedback; und B. Bohannan (University of Oregon, Eugene, USA), R. Knight (University of California San Diego, USA) und P. Engel (Université de Lausanne, Schweiz) für Ratschläge zum Manuskript. Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Projekt-ID 261376515 – SFB 1182, Projekte A4 und Z3 (NO, AC, FB, JL, A. Tholey, A. Traulsen, H. Schulenburg); das DFG-Forschungsinfrastruktur-NGS_CC-Projekt 407495230 (JF) im Rahmen des Next Generation Sequencing Competence Network-Projekts 423957469; die International Max-Planck Research School for Evolutionary Biology (NO, AC); die Max-Planck-Gesellschaft (Stipendium für H. Schulenburg); und NIH-Projekt R01AI168017 (MJGG, H. Sondermann).

Open access funding provided by Christian-Albrechts-Universität zu Kiel.

Thekla Schultheiß

Aktuelle Adresse: Institut für Toxikologie und Pharmakologie, Universität Kiel, Kiel, Deutschland

Abteilung für Evolutionsökologie und Genetik, Universität Kiel, Kiel, Deutschland

Nancy Obeng, Anna Czerwinski, Daniel Schütz, Jan Michels, Thekla Schultheiß, Melinda Kemlein & Hinrich Schulenburg

Abteilung für Systematische Proteomforschung und Bioanalytik, Universität Kiel, Kiel, Deutschland

John Leipert und Andrew Tholey

Max-Planck-Institut für Evolutionsbiologie, Plön, Deutschland

Florence Bansept, Arne Traulsen & Hinrich Schulenburg

CSSB Center for Structural Systems Biology, Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY, Hamburg, Deutschland

María J. García García & Holger Sondermann

Institut für Klinische Molekularbiologie, Universität Kiel, Kiel, Deutschland

Janina Fuß

Abteilung für Biologie, Universität Kiel, Kiel, Deutschland

Holger Sondermann

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NO, AC, FB, A. Traulsen und H. Schulenburg konzipierten das Projekt. NO, AC, MJGG und H. Sondermann haben die Methodik entwickelt. NO, AC, JM, JL, TS, MK und JF führten Untersuchungen durch. NO, AC, DS und FB analysierten Daten. NO, AC, DS, JM, JL, FB, MJGG, TS, MK, JF, A. Tholey, A. Traulsen, H. Sondermann und H. Schulenburg haben zum Verfassen des Manuskripts beigetragen. NO, A. Tholey, A. Traulsen, H. Sondermann und H. Schulenburg betreuten das Projekt. FB führte die Modellierung durch.

Correspondence to Hinrich Schulenburg.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Hassan Salem und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, b, Bakterienfitness während des Evolutionsexperiments. a: Bakterienfitness im Wirt über die Zyklen des Evolutionsexperiments hinweg, gemessen als koloniebildende Einheiten (KBE) pro Wurmpopulation nach 3,5 Tagen Exposition gegenüber Ce_MY316. b: In der Negativkontrolle wurde die bakterielle Fitness auf Nematoden-Wachstumsagar in Abwesenheit des Wirts beurteilt. Für jeden Datenpunkt wurden Bakterien zum Engpasszeitpunkt des angegebenen Zyklus gesammelt. Replikatpopulationen (n = 6) werden als separate dünne Linien dargestellt, wobei der Mittelwert als dicke Linie dargestellt wird. c, Mittlere KBE pro einzelnem Wirt in einer Wurmpopulation für die entwickelten Bakterienpopulationen von Zyklus 10. Fünf L4-Larven von C. elegans vermehrten sich 3,5 Tage lang auf entwickelten oder angestammten Bakterienrasen (erreichten die F1-Generation) und KBE wurden aus der gesamten Wurmpopulation extrahiert . Die KBE pro Population wurden durch die Anzahl der Würmer in der Population dividiert. Insgesamt werden die Ergebnisse als Boxplots dargestellt, wobei die Kästchen 25 % über und unter dem Median angeben, der als dicke Linie innerhalb der Kästchen angegeben ist; Replikatpopulationen (n=6) werden als einzelne Datenpunkte angegeben. d, e, Dynamische Veränderungen in der Morphotyp-Zusammensetzung während der freilebenden Phase des wirtsassoziierten Lebenszyklus für Bakterienpopulationen ab dem Ende des Evolutionsexperiments. c, Ergebnisse für die Replikatpopulationen aus der wirtsassoziierten Evolutionsbehandlung. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker). d, Ergebnisse für die Replikatpopulationen aus der Kontrollbehandlung. Die Anteile der verschiedenen Koloniemorphotypen (siehe Grafiklegende) werden über die Zeit des wirtsassoziierten Lebenszyklus hinweg angezeigt. Zeitpunkt 0 liegt am Ende der wirtsassoziierten Phase, wenn die Bakterien in die freilebende Phase übergehen, die ihrerseits 168 Stunden dauert. Fdr-korrigierte Beta-Regressionen wurden verwendet, um Proportionen vorherzusagen und auf eine Änderung der Proportionen im Laufe der Zeit zu testen (siehe Ergänzungstabelle 2).

Konfokale Laserscanning-Mikrofotografien (oberes Feld: optischer Längsschnitt; untere Felder: Projektionen mit maximaler Intensität, die optische Längsschnitte zeigen) zeigen intakte Bakterienzellen (rot) im Darmsystem eines jungen Erwachsenen Ce_MY316 (cyan). Die obere Aufnahme zeigt einen Überblick über den gesamten Wurm und die untere Aufnahme zeigt detaillierte Ansichten der Wurmabschnitte, die durch die gestrichelten Rahmen oben angezeigt werden. Dazu gehören der hintere Rachenraum mit dem Schneckenmahlwerk und dem ersten Darmring (links), ein Zentraldarm (Mitte) und die Analregion (rechts). Das Feld unten links ist identisch mit der im Haupttext gezeigten mikroskopischen Aufnahme (Abb. 1e). Maßstabsbalken = 50 µm (Übersicht) und 10 µm (Detailansichten).

Dargestellt sind Phänotypen von Morphotyp-Klonen, die aus unabhängigen Wirtspopulationen (links) und Kontrollpopulationen (rechts) isoliert wurden, einschließlich glatter, flockiger und faltiger Morphotypen. Die Ergebnisse für jede Morphologie werden als Boxplots zusammengefasst (1 < n < 4). Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker). Gestrichelte Linien und grau schattierte Bereiche zeigen den Mittelwert bzw. den Standardfehler der Vorfahrenmerkmale an. Unterschiede zwischen entwickelten Morphologien und dem Vorfahren wurden mit verallgemeinerten linearen Modellen und fdr-korrigierten Tukey-Post-hoc-Tests bewertet. Buchstaben geben statistische Unterschiede zwischen Morphologien an, Sternchen zeigen Abweichungen vom Vorfahren an (siehe Ergänzungstabelle 6).

a, Hauptkomponentenanalyse der charakteristischen Stadien der Wirtsassoziation für angestammte, vom Wirt entwickelte und von der Kontrolle entwickelte Bakterienpopulationen. Einzelne Datenpunkte beziehen sich auf Replikatpopulationen, die entsprechend der Evolutionsbehandlung gefärbt sind (Ergänzungstabelle 5). b–f, Verschiebungen der Phänotypen gegenüber dem bakteriellen Vorfahren in den entwickelten Populationen für (b) frühe Kolonisierung, bestimmt durch KBE, die aus L4-Larven extrahiert wurden, die 1,5 Stunden lang Bakterien ausgesetzt waren; (c) Persistenz in L4-Larven, die 1 Stunde lang in M9-Puffer gehalten wurden (auf Bakterien gezüchtet); (d) KBE von Bakterien, die innerhalb von 1 Stunde von L4-Larven in Puffer freigesetzt wurden (zuvor auf Bakterien von L1 bis L4 gezüchtet), (e) Schwarmentfernung auf 0,5 % Agar innerhalb von 24; und (f) Kolonieexpansion auf 3,4 % Agar innerhalb von 72 Stunden. Alle Panels zeigen Verhältnisse von evolvierten Populationen zu Vorfahrenpopulationen für fünf Replikate, dargestellt als einzelne Datenpunkte. Die gestrichelte Linie gibt die für die Vorfahrenpopulation ermittelten Mittelwerte an. Der Unterschied zwischen entwickelten und angestammten Phänotypen wurde mithilfe einseitiger T-Tests (fdr-korrigiert; Ergänzungstabelle 8) bewertet. In allen Boxplots werden der Median (Mittellinie), obere und untere Quartile (Boxgrenzen) und der Interquartilbereich (Whisker) angezeigt.

a, Menge an intrazellulärem c-di-GMP, gemessen mit einem Fluoreszenzsensor. Die Rohfluoreszenzintensität (RFI) ist das Verhältnis von TurboRFP (c-di-GMP-abhängig) und AmCyan (abhängig von der Plasmidkopienzahl) und wird somit auf die Kopienzahl des Sensorplasmids normalisiert. b, Gesamt-c-di-GMP, bestimmt durch Isotopenverdünnungs-PRM-Analyse. c, C-di-GMP, bestimmt durch Isotopenverdünnungs-PRM-Analyse und normalisiert durch die Gesamtproteinmenge. In a, b und c werden die c-di-GMP-Spiegel für den Vorfahren und drei faltige Isolate vom Ende des Evolutionsexperiments untersucht, jedes mit einer einzelnen Mutation in entweder wspF, wspE oder rph. Wir verglichen die c-di-GMP-Spiegel replizierender Zellpopulationen (n = 5). d: Intrazelluläres c-di-GMP von Isolaten vom Ende des Evolutionsexperiments mit faltiger, glatter und unscharfer Koloniemorphologie, gemessen mit einem Fluoreszenzsensor (verschachtelte ANOVA und fdr-korrigierter Dunnett-Post-Hoc-Test; n = 5). e, RFI der verschiedenen Isolate, normalisiert durch RFI der Vorfahren, um replikationsabhängige Effekte zu korrigieren (ANOVA und fdr-korrigierter Dunnett-Post-hoc-Test; n = 5; Ergänzungstabelle 10. Für entsprechende Mutationen siehe Ergänzungstabelle 9). Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker).

Oben zeigen Abbildungen von Proteindomänen die Organisation von WspF, WspE und Ribonuklease PH, wobei die von der Pl_MYb11-Mutation betroffenen Stellen durch rote Pfeile hervorgehoben sind. Nachfolgend werden Proteinsequenz-Alignments von angestammten und weiterentwickelten Proteinen gezeigt, wobei die Domänen in den gleichen Farben wie oben hervorgehoben sind.

a, Biofilmbildung von wspF-, wspE- und rph-Mutanten im Vergleich zu Pl_MYb11 (Ahnenmedian = gestrichelte Linie) nach zwei Tagen Schütteln von Inkubations-Mikrotiterplatten. Illustration von Biofilmen mit Fotografien von Biofilmen aus Reagenzgläsern nach 48-stündiger Inkubation. Maßstabsbalken = 4 mm. b, Schwarmmotilität und c, Kolonieexpansion der Isolate wspF, wspE und rph-Mutanten wurden nach 24 bzw. 72 Stunden mit Pl_MYb11 (Ahnenmedian = gestrichelte Linie) verglichen. v. Chr., Maßstabsbalken = 0,5 cm. ac, Experimente wurden mit min. durchgeführt. 3 Wiederholungen/Behandlung und Analyse mit ANOVA und fdr-korrigierten Dunnett-Post-hoc-Tests oder einem einseitigen t-Test. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker). d, Makrokolonien des Vorfahren Pl_MYb11 und drei faltige Isolate vom Ende des Evolutionsexperiments (mit einzelnen Mutationen entweder in wspF, wspE oder rph). e, Makrokolonien von ΔwspR-Mutanten im Pl_MYb11 wspF-, wspE- oder rph-Hintergrund. f, Makrokolonien von wspF-, wspE- oder rph-Isolaten, die die Phosphodiesterase PA2133 aus dem Plasmid exprimieren, Pl_ MYb11, das die konstitutiv aktive Diguanylatcyclase GCN4-WspR aus dem Plasmid exprimiert, und leere Vektorkontrollen. df, Makrokolonien wurden auf tryptischem Sojaagar, ergänzt mit Kongorot, für einen (d,e) bis drei (f) Tage gezüchtet. Maßstabsbalken = 1 mm.

Drei koevolutionäre Morphotypen, die aus der vom Wirt entwickelten Replikatpopulation T3 isoliert wurden, wurden mit dem Vorfahren gepaart. In einem Quartett war die wrinkly wspF-Mutante (MT12) vorhanden und im anderen die wrinkly wspE-Mutante (MT14). Datenpunkte stellen unabhängige Replikate dar, min. 3 Wiederholungen pro Behandlung. Unterschiede zwischen Morphotypen und Vorfahren wurden mithilfe eines linearen gemischten Modells und anschließender fdr-korrigierter Dunnett-Post-hoc-Vergleiche bewertet. siehe Ergänzungstabelle 13. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen) und den Interquartilbereich (Whisker).

Verteilung der Sequenzlängen und prozentuale Identitäten der BLAST-Ergebnisse für einzelne Gene. Der Anteil der BLAST-Ergebnisse, die zu bestimmten Sequenzlängen- und Prozentidentitätsklassen gehören, wird als blaue Farbtöne mit unterschiedlicher Intensität angezeigt (siehe Skala). Rote Rechtecke zeigen die Bereiche, für die das Vorhandensein des betrachteten Gens angenommen wird, und wurden so eingestellt, dass sie die größten BLAST-Trefferwerte sowohl bei maximaler Sequenzlänge als auch bei prozentualer Identität enthalten.

a, Definition der Raten für das Modell einer mikrobiellen Abstammungslinie, die von Würmern auf einer Platte aufgenommen, reproduziert und aus ihnen ausgestoßen wird. b, Verteilung der optimalen Strategien über den gesamten Merkmalsraum. c, Projektion des Merkmalsraums über die Achsen (r, δ). Für jeden Punkt der Karte stellt die Farbe das Verhältnis der Zeiten dar, in denen jede der vier möglichen Strategien optimal ist, und zwar integriert über die Werte von f und K. Das Farbschema verwendet den CMYK-Farbcode: ein reines Cyan (bzw. Magenta, Gelb) Pixel zeigt an, dass die einzig optimale Strategie für die betrachteten Werte (r, δ) ↓ δ (bzw. ↑ f, ↑K) ist. Eine dunklere Farbe zeigt an, dass ↑ r zu diesem Zeitpunkt auch in einem kleinen Verhältnis optimal ist, wie auf den zusätzlichen Farbskalen für jede Kante dargestellt.

Ergänzungstabellen 1–22.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Obeng, N., Czerwinski, A., Schütz, D. et al. Bakterielles c-di-GMP spielt eine Schlüsselrolle beim Aufbau der Wirt-Mikroben-Symbiose. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01468-x

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Eingegangen: 21. September 2022

Angenommen: 10. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01468-x

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